摘要：【目的】筛选对雌性尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）性腺发育影响最明显的催产激素组合及最佳剂量，为开展尼罗罗非鱼人工催产与繁殖提供参考依据。【方法】设计5组标准剂量的催产激素组合，分别为：①地欧酮（DOM） 6 mg/kg+促黄体素释放激素A2（LRH-A2）10 μg/kg；②DOM 6 mg/kg+促性腺激素释放激素类似物（GnRH-A4）8 μg/kg；③DOM 6 mg/kg+LRH-A2 10 μg/kg+绒毛膜促性腺激素（HCG）2000 U/kg；④DOM 6 mg/kg+LRH-A2 10 μg/kg+ HCG 2000 U/kg+鲤鱼脑垂体（PG）6 mg/kg；⑤DOM 6 mg/kg+LRH-A2 10 μg/kg+HCG 2000 U/kg+PG 6 mg/kg+GnRH-A4 8 μg/kg，并選择组合③进行1.0、1.5和2.0倍的激素剂量筛选试验，然后检测注射后0、24、36、48和72 h雌性尼罗罗非鱼血清类固醇激素[促性腺激素释放激素（GnRH）、促性腺激素（GTH）、雌二醇（E2）和孕酮（P）]的含量变化。【结果】雌性尼罗罗非鱼血清GnRH、E2含量于注射后24 h达最大值，GTH、P含量则在注射后36 h达最大值；其中，组合③、④和⑤引起的类固醇激素含量升高变化最明显，显著高于组合①和②（P<0.05，下同），但组合③、④、⑤间差异不显著（P>0.05，下同）。1.5倍标准剂量组引起的血清类固醇激素含量变化最明显，显著高于1.0和2.0倍标准剂量组，而1.0与2.0倍标准剂量组间无显著差异。【结论】进行尼罗罗非鱼人工繁殖时，使用多种催产激素组合的效果优于单一催产激素，且催产剂量一般应高于常规鱼类。
关键词： 尼罗罗非鱼；类固醇激素；催产激素；组合；剂量
中图分类号： S965.125 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）01-0128-06
0 引言
【研究意义】罗非鱼是世界性的重要水产养殖对象之一，具有生长快、繁殖力强、性成熟早（4～5个月即开始性成熟）、产卵周期短（隔25～35 d繁殖一次）等优点（蓝厚珍和赵福江，1988）。在自然环境下罗非鱼易繁殖，但人工繁殖却非常困难，主要是因为罗非鱼个体间性腺发育非同步性，卵子成熟过程短（刘筠等，1983），难以获得大量成熟卵子进行受精。而在罗非鱼的遗传育种研究中，如雌核发育、多倍体、远缘杂交，通常需要大量的成熟卵子（Chourrout and Itskovich，1983；Mair et al.，1987；Don and Avtalion，1988），因此，成熟卵子的获得已成为罗非鱼遗传育种工作的瓶颈问题。【前人研究进展】目前，国内外关于使用催产激素诱导罗非鱼性腺发育的研究报道相对较少。李建林和刘丽平（2006）通过对奥利亚罗非鱼（Oreochromis aureus）进行人工繁育，发现以地欧酮（DOM）4 mg/kg+促黄体素释放激素A2（LRH-A2）6 μg/kg对雌鱼的催产效果最佳，催产率为62.5%。李瑞伟等（2011）对吉富罗非鱼进行人工催产试验，认为绒毛膜促性腺激素（HCG）3000 U/kg+LRH-A2 15 μg/kg+DOM 9 mg/kg的催产效果最佳，催产率在66.0%左右。Fernandes等（2013）比较了几种单一催产激素（PE、HCG和GnRH）促进尼罗罗非鱼（O. niloticus）卵母细胞成熟与排卵的效果，发现以HCG诱导效果最佳，建议使用剂量为1000～5000 U/kg。魏继海等（2015）探讨了不同剂量催产激素对尼罗罗非鱼卵巢成熟过程中卵子形态、卵黄蛋白原含量及Vtg mRNA表达水平的影响，结果显示，以1.5倍剂量组对尼罗罗非鱼卵巢成熟发育影响变化最明显，激素注射后96 h，尼罗罗非鱼卵子成熟度最佳，可用于进一步的人工繁殖试验。【本研究切入点】通过注射或埋植外源激素，可在“脑—垂体—性腺”轴的某种或多种水平上外源性调节鱼体的内分泌活动，刺激内源激素的产生与分泌，诱导性腺成熟并排出精卵，但目前针对尼罗罗非鱼人工催产排卵的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】研究人工合成激素对雌性尼罗罗非鱼血清中各类固醇激素的影响变化，筛选出对雌性尼罗罗非鱼性腺发育影响最明显的催产激素组合及最佳剂量，为开展尼罗罗非鱼人工催产与繁殖提供技术支持。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
试验用雌性尼罗罗非鱼来自上海海洋大学罗非鱼种质资源试验站，体重450～650 g，均为1龄亲鱼。2014年7月28日通过挤卵观察法挑选性腺发育较好的雌鱼180余尾，然后转入室内水族箱（120 cm×60 cm×70 cm）中暂养，暂养期间水温25～27 ℃，pH 6.94～ 7.32，24 h不间断充氧。8月12～18日开展不同催产激素组合注射试验；8月24～30日开展不同剂量注射试验。促黄体素释放激素A2（LRH-A2）、绒毛膜促性腺激素（HCG）、地欧酮（DOM）和鲤鱼脑垂体（PG）购自宁波第二激素厂，促性腺激素释放激素类似物（GnRH-A4）购自四川省精科生化制品有限责任公司。
1. 2 激素注射
催产激素组合共设5组：①DOM 6 mg/kg+LRH-A2 10 μg/kg；②DOM 6 mg/kg+GnRH-A4 8 μg/kg；③DOM 6 mg/kg+LRH-A2 10 μg/kg+HCG 2000 U/kg；④DOM 6 mg/kg+LRH-A2 10 μg/kg+HCG 2000 U/kg+ PG 6 mg/kg；⑤DOM 6 mg/kg+LRH-A2 10 μg/kg+HCG 2000 U/kg+PG 6 mg/kg+GnRH-A4 8 μg/kg。注射相同剂量生理盐水作为空白对照组，每组注射5尾，3次重复。根据不同激素组合的试验结果，选用最佳的激素组合，其注射剂量分别为标配剂量1.0、1.5和2.0倍，每组注射5尾，空白对照组注射相同剂量的生理盐水。
1. 3 样品采集
注射催产激素后，分别于0、24、36、48和72 h从罗非鱼尾柄处抽取血液1～2 mL，4 ℃下静置6～8 h。血液完全凝集后3500 r/min离心20 min，吸出上层血清，-20 ℃保存备用。
1. 4 血清中类固醇激素含量测定
血清促性腺激素释放激素（GnRH）、促性腺激素（GTH）、雌二醇（E2）、孕酮（P）含量测定均使用上海酶联生物科技有限公司提供的ELISA试剂盒，按试剂盒说明进行测定（陈松林等，1995）。在BioTek Synergy酶标仪450 nm波长下测定其吸光值（OD），通过标准曲线计算各样品中的类固醇激素含量。
1. 5 统计分析
试验数据以Excel 2013软件进行整理，使用SPSS 18.0统计软件进行差异显著性分析，利用单因素方差分析法（ANOVA）对数据进行方差分析，并采用Duncan’s法进行多重比较。
2 结果与分析
2. 1 不同催产激素组合对雌性尼罗罗非鱼血清类固醇激素含量的影响
经不同催产激素组合催产后，雌性尼罗罗非鱼血清类固醇激素水平变化情况详见表1～4。注射后24 h，各激素注射组的雌性尼罗罗非鱼血清GnRH、GTH、E2、P含量均呈显著上升趋势（P<0.05，下同），其中，GnRH、E2含量于注射后24 h达最大值（表1和表3），GTH、P含量则在注射后36 h达最大值（表2和表4）；注射后48 h，各激素注射组的雌性尼罗罗非鱼血清类固醇激素含量均显著下降；至注射后72 h，各激素注射组与对照组的雌性尼罗罗非鱼血清类固醇激素水平基本一致。可见，注射不同催产激素后，均能引起雌性尼罗罗非鱼产生不同程度的催产效应。
通过对比不同催产激素注射组，发现注射后24 h，组合③、④和⑤的雌性尼罗罗非鱼血清GnRH、E2含量变化最明显，显著高于组合①和②（表1和表3）。除去5个激素组合中均含有DOM外，组合①中只含有LRH-A2、组合②只含有GnRH-A4，而组合③、④和⑤中含有两种及两种以上催产激素，因此推测，多种催产激素组合的催产效果比单一催产激素作用的效果更明显。组合③、④、⑤间差异不显著（P>0.05，下同），但以组合⑤的雌性尼罗罗非鱼血清GnRH、E2含量最高，进一步验证多种激素组合的催产效果更优。注射后36 h，组合③、④和⑤的雌性尼罗罗非鱼血清GTH、P含量显著高于组合①和②，组合①与组合②间差异显著，组合③、④、⑤间差异不显著，但以组合⑤的血清GTH、P含量最高（表2和表4）。在血清GTH、P含量方面，多种催产激素组合（组合③、④和⑤）的催产效果也优于单一激素的催产效果（组合①和②），其变化规律与血清GnRH、E2含量变化一致。
2. 2 不同催产激素剂量对雌性尼罗罗非鱼血清类固醇激素含量的影响
从经济实用角度考虑，本研究选择组合③（DOM 6 mg/kg+LRH-A2 10 μg/kg+HCG 2000 U/kg）进行催产激素剂量筛选试验。由图1可以看出，注射不同剂量催产激素后，雌性尼罗罗非鱼血清类固醇激素含量的变化趋势与不同催产激素组合注射后的变化趋势一致，即血清GnRH、E2含量在注射后24 h达最大值，而血清GTH、P含量在注射后36 h达最大值。不同剂量催产激素注射组的雌性尼罗罗非鱼血清GnRH、E2、GTH、P含量均显著高于对照组；不同剂量催产激素注射组间比较，其结果显示，1.5倍标准剂量组的血清类固醇激素含量显著高于1.0和2.0倍标准剂量组，但1.0与2.0倍标准剂量组间无显著差异。说明适量增大催产剂量可提高催产效果。
3 讨论
GnRH是由下丘脑分泌细胞合成与分泌，通过刺激垂体前叶释放GTH，以调节脑垂体分泌活动及性腺发育的主要激素之一（Amono et al.，1997）。GTH在许多硬骨鱼类中存在两种类型：GTH-I和GTH-Ⅱ。其中，GTH-I具有促进卵黄蛋白原进入卵母细胞的作用，GTH-Ⅱ则能刺激性激素生成、配子发生与成熟、排卵（Idler et al.，1975；Swanson et al.，1991）。E2是由卵巢卵泡细胞所分泌，能够促进卵巢发育、副性征出现、排卵后卵巢的再发育及促使肝脏合成卵黄蛋白原（Holland et al.，2000）；而P分泌水平与卵母细胞成熟有关，首先被转化为17α-羟孕酮（17α-OHP），再被转化为17α，20β-双羟孕酮（17α，20β-DHP），而诱导卵母细胞最后成熟及排卵（Comeau et al.，2001）。本研究中，以不同催产激素组合注射雌性尼罗罗非鱼后，均可引起其血清类固醇激素（GnRH、GTH、E2和P）含量明显升高，其中，GnRH、E2含量在注射后24 h达最大值，随着时间推移，GnRH、E2含量逐渐下降，至注射后72 h接近正常水平；GTH、P含量在注射后24 h显著上升，36 h达最大值，之后也呈逐渐下降趋势。雌性尼罗罗非鱼血清中不同类固醇激素的应答时间存在先后顺序差异（GTH晚于GnRH，P晚于E2），可能是垂体中GTH的合成与分泌活动直接受下丘脑GnRH分泌水平调节，由于P的主要生理作用是诱导卵巢最后成熟及排卵，其分泌一般晚于雌激素分泌是受内分泌系统自身调控，与团头鲂（Megalobrama amblycephala）（姜仁良等，1986）、大鳞副泥鳅（Paramisgumus dabryanus）（宋艳等，2007）、条斑星鲽（Verasper moseri）（倪娜等，2011）等产卵前E2、P表达最高峰时期顺序基本一致。
不同催产激素组合对血清类固醇激素含量变化的影响不尽相同。本研究中，组合③、④和⑤的影响作用显著高于组合①和②。组合③、④和⑤中均含有HCG、LRH-A2和DOM，推测HCG（或HCG+LRH-A2）对雌性尼罗罗非鱼血清类固醇激素含量影响作用更显著，与Fernandes等（2013）的研究結果一致，即单一激素条件下，HCG的诱导效应高于LRH-A2和GnRH-A4。LRH-A2主要作用于脑垂体，引起促卵泡素和促黄体素生成，促使卵巢成熟及排卵（龙进等，2004）；而HCG具有促使性腺成熟发育、性激素产生、促进排卵、促黄体产生等生理作用（左永松等，2013）。DOM为多巴胺（DA）拮抗物，DA在垂体水平可阻抑GnRH和GTH的合成与释放，注射DOM可在垂体水平上消除DA的抑制作用，间接促进类固醇类激素的合成与分泌。比较组合③、④和⑤的注射效应，发现继续增加激素种类如PG和GnRH-A4，虽然对雌性尼罗罗非鱼血清类固醇激素含量上升仍有一定的促进作用，但不同催产激素组合间的效应差异不显著，其原因或许与多种激素组合的效应间存在一定拮抗或抑制作用有关。从经济实用角度考虑，组合③（DOM 6 mg/kg+LRH-A2 10 μg/kg+ HCG 2000 U/kg）是引起雌性尼罗罗非鱼血清类固醇激素含量变化作用最佳的激素组合，与吉富品系尼罗罗非鱼人工催产中的激素组合（李瑞伟等，2011）基本一致。
不同剂量催产激素的催产效果也不同，剂量过低其催产效果不明显，剂量过高则可能抑制催产效果甚至引起亲鱼死亡（宋艳等，2007）。激素剂量效应可能是通过受体效应、信号通路及负反馈调节等共同作用实现。本研究中，1.5倍剂量组的雌性尼罗罗非鱼血清类固醇激素含量变化显著高于1.0和2.0倍剂量组，2.0倍剂量组与1.0倍剂量组间无显著差异。这可能是2.0倍剂量组浓度过高，通过负反馈调节途径，在一定程度上抑制了“脑—垂体—性腺”轴的分泌活动，而未能引起血清类固醇激素含量明显上升。因此，确定1.5倍剂量组（DOM 9 mg/kg+LRH-A2 15 μg/kg+HCG 3000 U/kg）为雌性尼罗罗非鱼的最佳催产激素诱导水平，生产上可推广应用。此外，雌性尼罗罗非鱼性腺发育属于非同步型，催产前需通过人工挤卵方法判断亲鱼的成熟度。经实践证实，尼罗罗非鱼人工繁殖的最佳时机宜选择在越冬后第一次产卵前，此时性腺发育相对整齐，挑选获得成熟度好的亲鱼机率较大。
4 结论
进行尼罗罗非鱼人工繁殖时，使用多种催产激素组合的效果优于单一催产激素，且催产剂量一般应高于常规鱼类。
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（責任编辑 兰宗宝）