[摘要] 目的:研究荧光原位杂交技术在检测宫颈脱落细胞中hTERC基因扩增情况,为女性子宫颈病变的筛查、早期诊断及预后提供新途径。方法:收集60例妇女患者进行宫颈脱落细胞的液基细胞学检查(TCT)、第2代杂交捕获法(HC2)高危型人乳头瘤病毒(HPV)检测(HPV-DNA)、FISH法hTERC基因检测及经阴道镜下宫颈活检病理证实,做出宫颈病变的最后诊断。结果:随着细胞学病变程度的加重及宫颈上皮内瘤变(CIN)级别增加,hTERC基因扩增阳性率增加(χ2=11.111,χ2=10.824,P<0.05);HPV感染率随着细胞学病变程度的加重而升高(χ2=6.570,P<0.05);HPV阳性患者中hTERC扩增明显高于HPV阴性患者(χ2=38.723,P<0.05)。结论:hTERC基因扩增与宫颈细胞学和组织学密切相关,通过hTERC基因是否扩增可以很好区分低度与高度病变,hTERC基因的扩增可能是HPV感染致端粒酶活性增加的早期事件。
[关键词] 宫颈上皮内瘤变;人乳头瘤病毒;荧光原位杂交;hTERC基因
[中图分类号] R711.74 [文献标识码]A [文章编号]1674-4721(2010)06(a)-009-03
Clinical significance by application of FISH to detect the amplification of hTERC gene in cytological specimens of cervix
ZHAO Donghui,LU Yisheng,HE Jianfang,YE Weibiao,WEN Yongqin
(Department of Pathology, People"s Hospital of Dongguan City,Guangdong Province, Dongguan 523018, China)
[Abstract] Objective: To investigate hTERC gene amplification using FISH in cytological specimens of the cervix and provide a new way in screening cervical lesions, early dignosis, prognosis for female. Methods: The hTERC gene was detected by FISH in 60 samples and was confirmed pathologicaly by cervical biopsy using colposcopy after liquid-based cervical cytology of cervical exfoliated cells(TCT), high risk HPV-DNA detection by HC-II. Results: hTERC gene amplification positive rate was raised with the cytological lesions aggravation and CIN levels increasing(χ2=11.111,χ2=10.824,P<0.05);HPV positive rate was raised with cytological lesions aggravating(χ2=6.570,P<0.05);hTERC gene amplification of HPV(+) was higher than HPV(-)(χ2=38.723,P<0.05). Conclusion: hTERC gene amplification is associated with cervical cytology and histology, hTERC gene amplification or not can differentiate low and high lesions, hTERC gene amplification may be an early stage event related to activation of telomerase resulted from HPV infection.
[Key words] Cervical ihtraepithelial neoplasia;Human papillomavirous;Fluorescence in situ hybridization;hTERC gene
宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤,研究表明,人乳头瘤病毒(human papillomavirous, HPV)感染与宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)、宫颈浸润癌密切相关,具有高度危险性的HPV16型持续感染并与染色体整合致基因组不稳定对肿瘤的发生起了关键作用[1]。目前宫颈癌筛查主要通过宫颈细胞学检查及HPV检测进行,这些方法的临床应用有一定局限性。荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization, FISH)可用来研究细胞核中染色体数量和结构异常,本实验采用特异性DNA探针,检测宫颈脱落上皮中3号染色体长臂端粒酶基因(human telomerase RNA component,hTERC)的扩增情况(位于3q26.3),来研究HPV感染对端粒酶基因的影响。
1资料与方法
1.1 一般资料
收集2009年9～12月在本院妇产科门诊行液基细胞学(TCT)检查、HPV-DNA检测及经阴道镜病理活检证实患者60例,年龄21～70岁,平均38岁。TCT结果中:无上皮内病变或恶性病变(NILM)10例;意义不明的非典型鳞状上皮细胞(ASCUS)6例;低度鳞状上皮内病变(LSIL)7例;高度鳞状上皮内病变(HSIL)14例;宫颈浸润癌(SCC)23例。采用第2代杂交捕获法(HC2)行HPV-DNA检测,FISH法行hTERC基因扩增检测。
1.2试验方法
1.2.1 TCT采用美国新柏氏液基细胞学制片技术,依照TBS细胞学分级做出诊断。
1.2.2高危型HPV检测采用基因杂交捕获HC2法(美国DIGENE公司研发)进行测定。
1.2.3组织病理学阴道镜下组织活检,HE染色后镜检,提供最终病理诊断结果。
1.2.4 FISH检测①制片:将TCT保存瓶中剩余液体用制片机制成玻片,56℃烤片机老化30 min或室温下过夜老化;②消化:2×SSC液洗2次(5 min),0.1 mol/L HCL(10 min),37℃ 0.01 mol/L HCL/胃酶(10 min),2×SSC液洗2次(5 min);③脱水:70%、85%、100%乙醇梯度脱水各3 min,自然干燥;④变性:56℃烤片机加热5 min,70%甲酰胺2×SSC液(75℃)水浴中变性5 min,然后立即-20℃乙醇梯度脱水各3 min,自然干燥后,46℃烤片机烤干等待杂交;⑤杂交:将配好的杂交探针(CSP 7 μl、hTERC 2 μl、去离子水1 μl)在75℃水浴中变性5 min,然后立即加到玻片上,盖上盖玻片,封片,置于湿盒内,将湿盒置于42℃恒温孵箱中过夜杂交;⑥洗片:将杂交后的玻片置于47℃50%甲酰胺/2×SSC液(10 min,47℃),3次(10 min),2×SSC液(10 min,47℃),NP-40洗5 min(47℃),洗涤完毕后,将玻片置于70%乙醇中3 min,自然干燥后,加15 μl DAPI,加盖玻片,暗处放置10～20 min;⑦阅片:荧光显微镜下观察细胞核中红绿荧光信号;红色荧光信号为3q26.3位点(目标信号),绿色荧光信号为3号染色体着丝粒(参照信号)。
1.3 FISH判断标准
应用hTERC基因双色探针(hTERC探针购置于北京金菩嘉医疗科技有限公司,为TERC/CSP3DNA探针),HPV阴性、病理诊断为炎症的宫颈脱落上皮中hTERC基因杂交信号为标准确定。取涂片,分别计数100个细胞,记录hTERC基因超过2个杂交信号的异常细胞数(即细胞中出现绿:红<2:2的百分比)。阈值=异常细胞均数+3个标准差,超过此阈值则可诊断为hTERC基因扩增阳性。
1.4统计学方法
结果采用SPSS 13.0统计软件进行分析,采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
宫颈脱落细胞标本与TERC/CSP3DNA探针杂交后,均可清晰地看到红色及绿色的探针杂交信号亮点。
2.1细胞学结果
NILM者hTERC基因扩增阳性率为0;ASCUS者为16.67%,LSIL者为71.43%,HSIL者为92.86%,SCC者为100.00%。这表明随着宫颈病变级别增加,hTERC基因扩增阳性率也逐渐增加,hTERC基因扩增在细胞学中存在差异,并随着细胞学病变程度的加重而升高(χ2=11.111,P<0.05),见表1。
2.2组织病理学结果
正常或炎症者hTERC基因扩增阳性率为0,CINⅠ级患者为20.00%,CINⅡ级患者为33.33%,CINⅢ级患者为88.24%,宫颈癌患者为100.00%。这表明hTERC基因扩增在CINⅢ及以上级别病变中明显高于CINⅡ及以下病变,随着组织学病变程度的加重,hTERC基因扩增阳性率也逐渐增加,hTERC基因扩增在不同程度组织学病变中存在差异(χ2=10.824,P<0.05),见表2。
2.3 HPV感染与细胞学分级关系
HPV感染在NILM均为阴性,HPV感染阳性率在ASCUS、LSIL、HSIL+SCC病变中分别为0、42.86%、100.00%,随细胞学病变程度的加重,HPV感染率呈上升趋势(χ2=6.570,P<0.05),见表3。
2.4 HPV感染与hTERC基因扩增关系
HPV感染阳性中hTERC基因扩增显著高于HPV阴性者,二者比较差异有统计学意义(χ2=38.723,P<0.05),见表4。
3讨论
目前宫颈癌筛查主要通过宫颈细胞学检查及HPV检测,但这些方法均不能达到较高的敏感性和特异性。FISH技术是采用直接或间接荧光标记的DNA特异性探针与靶细胞中同源序列的核酸进行杂交,以实现对目的DNA片段或基因的定量和定位分析,可准确鉴别染色体异位和非整倍体[2]。通过FISH检测宫颈细胞学涂片中hTERC基因扩增情况,在宫颈癌和癌前病变诊断中有重要价值,尤其是鉴别出高度病变,提高了筛查的准确性和可预测性。
HPV属于乳头状病毒科A亚群内的一组DNA病毒,为嗜上皮性病毒,该病毒直径50～60 nm,球形,无包膜,20面体立体堆成的核衣壳结构,表面有72个壳微粒,内含8 000个碱基对,分子量5×106 D,基因组是双链环状结构DNA,有3个功能区:早期转录区(E1、E7);晚期转录区(L1、L2);长控制区即非转录区。早期转录区参与病毒DNA复制、转录、翻译调控和细胞转化等功能;晚期转录区可诱导机体产生对HPV的中和抗体,与病毒的增殖有关;非转录区可能对病毒的复制及转录起调节作用。当高危型HPV整合到宿主DNA后,E6、E7可使抑癌基因P53、pRB失活,它们的失活在肿瘤开始发生时起关键作用,凋亡因此受到抑制而发生非程序性增生[3]。Anedcheko E等[4]认为HPV感染尤其是高危性HPV感染使宫颈组织端粒酶激活,是导致最终癌变的重要因素。Andersson S等[5-6]实验表明染色体突变与HPV感染密切相关,认为HPV病毒整合到人类DNA中导致了肿瘤的发生。
端粒酶是一种逆转录酶,可以以自身的RNA为模板合成端粒DNA而避免端粒的缩短。人端粒酶RNA(hTERC)是人端粒酶组分之一,主要由两部分组成:催化亚单位(human telomerase reverse transcriptase, hTERT),RNA模板(huamn telomerase RNA, hTR)和端粒酶相关蛋白。人体大部分体细胞不表达端粒酶,只有在生殖细胞、胚胎细胞中才有表达,而在恶性肿瘤中,端粒酶却能被激活而使细胞获得永生化。hTERC位于3号染色体长臂2区6带(3q26),它编码hTR,在人类的许多肿瘤中都发现有hTERC扩增。在对宫颈病变的研究中,宫颈细胞由非典型性发育异常向宫颈癌转变的过程中几乎都伴有3号染色体长臂的扩增,其中,所涉及最重要的基因可能是人染色体端粒酶基因[7]。研究表明,3q26/8q24扩增的患者进展为宫颈高度病变的风险很大。在宫颈癌及其癌前病变中,端粒酶活性有不同程度的升高,端粒酶激活是高危型HPV感染后导致CIN和宫颈癌的关键步骤,故端粒酶检测成为宫颈癌筛查的一种重要肿瘤标志物。Heselmeyer等[8]首次将FISH三色探针用于宫颈细胞涂片,检测到 hTERC基因扩增,发现在CINⅡ中,该基因扩增者为63%,CINⅢ中为76%,而且可将CINⅡ、Ⅲ级与ASCUS、CINⅠ级区分开来。Nancy P等[9]观察了不同程度宫颈病变中hTERC扩增情况,NILM 0%,ASCUS 13%,LSIL 70%,HSIL 100%,SCCA 100%,hTERC基因的扩增情况随细胞学病变的加重而升高,这与本实验结果基本一致。Heselmeyer等[10]随访这些病例1～3年后,hTERC基因扩增的妇女进展为CINⅢ或浸润癌,故可以把检测细胞涂片中hTERC扩增作为常规手段来判断LSIL向HSIL进展的风险,大大减少细胞学筛查的漏诊率。李静然等[11]发现CIN和宫颈癌组hTERC基因拷贝数明显增加,前者平均拷贝数是2.8,后者是3.2,表明hTERC与宫颈病变程度密切相关,hTERC基因扩增可作为预测高度病变的独立指标。
本实验结果表明,通过FISH法检测hTERC基因是否扩增可很好的区分宫颈低度与高度病变,组织学和细胞学相结合检测可进一步确定诊断,通过对东莞市女性HPV检测、hTERC基因表达的研究,为中国妇女宫颈癌的筛查、早期诊断及预后评价提供了新的途径。
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(收稿日期:2010-04-09)